25岁，如今已是生物物理学学士，女朋友MJ是全纽约最好的记者。彼得被放射性蜘蛛咬伤，因此获得了超能力，并化身蜘蛛侠，他利用超能力帮助这座城市，阻止了许多想要伤害这座城市的人，比如导师奥托·奥克维塔斯博士。他的实验室被前同事诺曼·奥斯本关停了，奥托通过释放生物武器进行报复。彼得阻止了这一切，只是代价惨痛，梅婶因此失去了生命。
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迈尔斯·墨拉莱斯
17岁，就读于布鲁克林远见学院，时不时地在哈莱姆区给妈妈打下手，他的妈妈是女议员里奥·墨拉莱斯。当然，迈尔斯也被放射性蜘蛛咬了，同样获得了超能力，他的目标就是向初代蜘蛛侠学习如何当好蜘蛛侠。他也向他的父亲学习如何当好一名英雄，他做好事也是源于他的父亲，他的父亲殉职于马丁·李的市政厅爆炸案，这成为了迈尔斯的心结。
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玛丽·简·沃森
她不仅是《号角日报》的记者，也是蜘蛛侠团队的重要成员，从她身上可以看出，要当一个英雄并不一定需要拥有超能力。
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哈利·奥斯本
诺曼·奥斯本的儿子。过去这几年，他一直在为曾夺走他母亲性命的同一种遗传疾病接受治疗，但他现在以新生的姿态回来了。
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诺曼·奥斯本
他是哈利的父亲，世界上最大科技公司的共同创办人，也是恶名昭彰的前纽约市长。他是个病态的骗子，但他也会尽一切努力帮助哈利。
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里奥·墨拉莱斯
有些人知道她是迈尔斯的酷妈，但大多数人所知道的则是那个为了让纽约变成更好、更安全的地方而努力不懈的市议员里奥·墨拉莱斯。
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甘其·李
迈尔斯的死党与知己，也是他在执行英雄行动时的伙伴。甘其是迈尔斯第二个选择说出自己是蜘蛛侠这件事的对象。
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海莉·库珀
她是个社区活动参与者、街头艺术家，也是迈尔斯非常要好的朋友。她这个人充满创意、聪明有趣且富有同情心，尤其如果你是问迈尔斯的看法的话。
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反派-毒液
这个拥有强大力量的庞然凶兽宛如一阵狂暴扭曲的自然灾害席卷纽约。这座城市多年来已经历各种威胁，但像这样的存在仍属少见。
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反派-蜥蜴人（康纳斯博士）
彼得在大学里遇到了10英尺高、失控的“蜥蜴人”。如今，康纳斯博士已经摆脱了过去，成为哈利·奥斯本的私人医生。
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反派-克雷文
神秘力量深不见底，当前还不清楚这个“克雷文”究竟是何方神圣。他来到此地显然有明确目的。不论目的为何，我们的两名蜘蛛侠只要在他们行动前阻止他就行。
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